Программа миньон: Minion — Premier AddOn Management

Секвенирование нанопор в сочетании с обогащением мишеней на основе CRISPR / Cas9 позволило профилировать SNV, SV, метилирование и аллельное фазирование ключевых генов, связанных с раком.

Технические характеристики

Длина считывания

Нанопоры считывают длину представленной им ДНК или РНК — от короткой до сверхдлинной (самая длинная> 4 Мб)

Размеры

• Размер: Ш 105 мм, В 23 мм, Г 33 мм
• Вес: 87 г

Подходящие приложения включают

• Целые геномы / экзомы
• Метагеномика
• Целевое секвенирование
• Полный транскриптом (кДНК)
• Меньшие транскриптомы (прямая РНК)
• Мультиплексирование для меньших образцов

Высокая урожайность

До 50 Гб на каждую проточную кювету MinION / 2. 8 Гб на проточную кювету с фланцем *

* Теоретическая максимальная производительность при работе системы 72 часа (или 16 часов для Flongle) со скоростью 420 базовых данных в секунду. Выходные данные могут отличаться в зависимости от типа библиотеки, условий работы и т. Д.

Возможности подключения

Весит менее 100 г и подключается к ПК или ноутбуку с помощью высокоскоростного кабеля USB 3.0.

Низкая стоимость

• Стартовые пакеты от 1000 долларов США, включая расходные материалы
• Совместимость с проточными ячейками Flongle для небольших тестов и анализов
• Комплекты мультиплексирования для более высокой производительности пробы

Длина считывания

Нанопоры считывают длину представленной им ДНК или РНК — от короткой до сверхдлинной (самая длинная> 4 Мб)

Размеры

• Размер: Ш 140 мм, В 30 мм, Г114
• Вес: 450 г

Подходящие приложения включают

• Целые геномы / экзомы
• Метагеномика
• Целевое секвенирование
• Полный транскриптом (кДНК)
• Меньшие транскриптомы (прямая РНК)
• Мультиплексирование для меньших образцов

Высокая урожайность

До 50 Гб на каждую проточную кювету MinION / 2. 8 Гб на проточную кювету с фланцем *

* Теоретическая максимальная производительность при работе системы 72 часа (или 16 часов для Flongle) со скоростью 420 базовых данных в секунду. Выходные данные могут отличаться в зависимости от типа библиотеки, условий работы и т. Д.

Универсальное устройство

• Сенсорный экран высокого разрешения — простое управление устройством и визуализация результатов
• Полная связь — LAN и Wi-Fi включены
• Интегрированные мощные вычислительные ресурсы — предустановленное программное обеспечение для обработки вызовов и анализа

Низкая стоимость

• Стартовые пакеты от 4900 долларов США, включая расходные материалы
• Совместимость с проточными ячейками Flongle для небольших тестов и анализов
• Комплекты мультиплексирования для более высокой производительности пробы

Документация по продукту

MinION Mk1B Краткое руководство пользователя

Это краткое руководство содержит все необходимое для установки MinION Mk1B и проверки готовности устройства к использованию.

218 КБ PDF

MinION Mk1B Характеристики устройства

Полная техническая спецификация MinION Mk1B

1 МБ PDF

MinION Mk1B IT-требования

Этот контрольный список представляет минимальные требования для установки MinION в вашем учреждении.

670 КБ PDF

Информация по безопасности и нормативным требованиям

110,7 КБ PDF

MinION Mk1C Краткое руководство

Все необходимое для установки MinION Mk1C и проверки готовности устройства к работе.

333 КБ PDF

MinION Mk1C ИТ-требования

Этот контрольный список представляет минимальные требования для установки MinION Mk1C в вашем учреждении.

67 КБ PDF

Ваш браузер не поддерживает видео тег.

Руководство по аддонам ESO: установка аддонов и устранение неполадок с миньонами

Перед тем, как перейти к шагу 1, обязательно сначала запустите ESO, если вы выполнили новую установку игры, а затем игра автоматически создаст папку аддонов для вас. в пути к файлу документов (ПК / Mac)!

Шаг 1) Зайдите на сайт ESOUI и выберите аддон, любой аддон, который вы хотите!

Шаг 2) Загрузите и откройте сжатый файл (мы настоятельно рекомендуем получить онлайн-программу WinRar для извлечения / просмотра этих загруженных файлов)!

Шаг 3) Щелкните и перетащите папку с содержимым в «Документы»> «Elder Scrolls Online»> «Live»> «Дополнения».

Шаг 4) Если вы вошли в систему как персонаж в ESO, просто введите / reloadui в игровой чат и нажмите Enter! Не нужно перезапускать игру! Если вы сделали это, когда игра не была запущена, вы можете получить доступ к разделу «Дополнения» на экране входа в систему персонажа после входа в ESO.

Шаг 5) Обратите внимание, что для работы определенных надстроек вам потребуется загрузить определенные файлы, которые называются «Библиотеками». Эти библиотеки можно найти на веб-сайте ESOUI, а также вместе с файлами надстроек.

Шаг 6) В качестве окончательной проверки после установки аддона и проверки в игре убедитесь, что «Устаревшие аддоны» как устаревшие аддоны (при условии, что они не сильно устарели) все еще работают. Некоторые разработчики аддонов не утруждают себя обновлением аддонов или их названий версий, если в API не произошли радикальные изменения.

Если вы хотите избавиться от избранных надстроек, все, что вам нужно сделать, это просто удалить надстройки из папки надстроек в ваших документах!

Как и при ручной установке дополнений, убедитесь, что у вас есть папка Addons в папке Documents> ElderScrollsOnline> Live, запустив игру, если это новая установка.

Шаг 1) Перейдите на сайт Minion и загрузите клиент Minion.

Шаг 2) После установки клиента Minion убедитесь, что он просканирует все ваши диски. Это ошибка №1, которую делают многие люди. Имеет смысл позволить ему сканировать только диск, на котором находится ESO, но это может привести к ошибке Minion.

Шаг 3) В отличие от ручной установки, Minion ищет вас в ESOUI, и вы можете просто загружать дополнения без WinRar или перетаскивать файлы.По сути, клиент Minion автоматизирует все для вас, включая возможность обновлять все ваши дополнения одним щелчком мыши.

Шаг 4) Однако вам также необходимо убедиться, что необходимые файлы библиотек по-прежнему загружаются через Minion для работы определенных надстроек.

Шаг 5) В качестве окончательной проверки после установки аддона и проверки в игре убедитесь, что «Устаревшие аддоны» как устаревшие аддоны (при условии, что они не сильно устарели) все еще работают.Некоторые разработчики аддонов не утруждают себя обновлением аддонов или их названий версий, если в API не произошли радикальные изменения.

И все! Для получения дополнительной информации см. Видео выше.

Oxford Nanopore MinION: предоставление секвенирования нанопор сообществу геномиков | Геномная биология

4.

Черф Г.М., Либерман К.Р., Хитем Р., Лам С.Е., Кевин К., Марк А. Автоматическое прямое и обратное храповидное соединение ДНК в нанопоре с точностью 5 Å. Nat Biotechnol. 2012; 30: 344–8.

CAS Статья PubMed PubMed Central Google Scholar

31.

Quick J, Quinlan AR, Loman NJ. Эталонный набор данных бактериального генома, созданный на портативном одномолекулярном нанопорном секвенаторе MinION ™. Gigascience. 2014; 3: 1–6.

Артикул Google Scholar

35.

Ван младший, Джонс CD. Быстрая фильтрация выравнивания считываний секвенирования нанопор с использованием хеширования с учетом локализации. Международная конференция IEEE по биоинформатике и биомедицине (BIBM), 2015 г. 2015. DOI: 10.1109 / bibm.2015.7359668.

Оценка устройства для секвенирования MinION от Oxford Nanopore для приложений микробного секвенирования цельного генома

Было выполнено 15 прогонов в течение девяти месяцев с 2016 по 2017 гг. В ходе экспериментов тестировались 2D-, 2D-секвенирование со штрих-кодированием, 1D-секвенирование со штрих-кодированием и 1D-наборы для быстрого набора, а также применялась самая последняя версия программного обеспечения на момент создания данных для анализа (дополнительная таблица 1).

Качество проточной ячейки — количество пор

Все проточные ячейки spotON R9.4 и R9.4 были получены с количеством пор, превышающим гарантированный уровень (800 пор). Было измерено количество пор во время использования, результаты представлены в дополнительной таблице 2. Ранние проточные кюветы R9.4 (не для SpotON), которые хранились в течение более длительных периодов времени перед использованием (4 ° C согласно ONT), были в большинстве случаев часть, более низкого качества во время секвенирования, чем сразу после получения. Более поздние проточные кюветы (R9.4 SpotON) имели такое же или даже более высокое качество после хранения, вероятно, из-за изменений в протоколах оценки пор, реализованных программным обеспечением MinKNOW.

Результат секвенирования

Результат секвенирования на цикл показан на рис. 1 с обозначением как общего числа считываний, так и используемых (проходящих) считываний. Первый набор образцов был классифицирован Epi2Me (облачное программное обеспечение Metrichor для базового вызова) как пройденный или неудачный с последовательностями, которые были успешно проанализированы в 2D, демультиплексированы, и для этой классификации был применен минимальный средний балл качества 6. Выполнения с базовыми операциями чтения, названными albacore, включены во второй блок и включали все чтения, которые имели успешный двухмерный базовый вызов и были демультиплексированы, независимо от окончательной оценки качества.Для последних 4 прогонов базовый вызов и демультиплексирование были выполнены MinKNOW (1D). Кроме того, пропущенные чтения (те, которые не были обработаны MinKNOW во время секвенирования) также были сгенерированы и также описаны. В среднем 61 848 (максимум 273 102), 160 132 (максимум 598 238) и 9641 (максимум 29 632) пройденных считывания было сгенерировано для наборов 2D, 1D и quick 1D соответственно. Обратите внимание, что оба цикла L1-2D-FAB37836-PCR и L1-1D-FAF18512-NAT сгенерировали значительно больше данных, чем было сгенерировано в любом из других циклов.Это количество данных не дублировалось в двухмерных или одномерных прогонах. По нашему опыту, а также по опыту, описанному другими пользователями Oxford Nanopore, большая часть данных о последовательностях генерируется в первые восемь часов секвенирования, что соответствует времени, когда первая группа пор активно секвенируется. Важно отметить, что отсутствие автоматической фильтрации выходных данных из Albacore в более поздних запусках частично объясняет увеличение доли считываний, называемых «Пройдено». Однако это позволило нам оценить качество как исходных данных, так и влияние различных показателей контроля качества на последующий анализ.Качество считывания, которое было сгенерировано, в целом улучшалось по мере продвижения исследования, при этом более ранние запуски характеризовались как более короткими считываниями, так и более низкими качествами выходных данных (рис. 2).

ДНК в количестве считываний, которые были проанализированы далее (проход), и считываний, которые были исключены либо на основании внутренних параметров фильтрации Epi2Me, либо на основании невозможности демультиплексирования (сбой) на каждой из протестированных проточных ячеек. FAB-R9.4; FAF- R9.4 SpotOn. Первый набор образцов был оценен с помощью Epi2Me, второй набор — Albacore, а третий — методом прямого определения оснований MinKNOW.* Для этого образца был добавлен второй цикл доливки через 1 час после начала секвенирования.

Среднее качество на окно 2000 пар оснований для каждого из запусков MinION, включенных в этот анализ, рассчитанное с использованием fastqc ³² . Линии расширяются по мере увеличения длины считывания. Более ранние прогоны характеризовались как более коротким чтением, так и созданием выходных данных более низкого качества. L1-2D-FAB29623 разбит на до и после, что касается качества чтения до и после применения промывочного буфера.

Влияние последовательного добавления образцов на генерацию данных

Чтобы устранить эффект «складывания», добавление вторичного образца в проточную ячейку MinION либо после этапа промывки, либо путем простого добавления его в текущий цикл, Лаборатория 1 (L1 ) последовательно секвенировали F. hispaniensis и Y. rohdei . Когда сначала секвенировали F. hispaniensis , а затем остановили программное обеспечение для секвенирования, применили промывочный буфер и перезапустили цикл, мы наблюдали резкое падение количества активно секвенирующих пор после перезапуска (с 1092 до 555).За четыре часа до промывки было сгенерировано 9003 считывания двумерных проходов. 99,8% из них были успешно сопоставлены с F. hispaniensis , что соответствует расчетному среднему охвату 35,9x. Такой высокий уровень чистоты ожидается, учитывая, что это был единственный организм, отложившийся в проточной кювете в то время. В течение последующих 48 часов, в течение которых проточная ячейка работала после применения промывочного буфера и добавления Y. rohdei , было сгенерировано только 751 успешно вызванное 2D считывание.Из этих 751 чтения 31,2% соответствовали геному F. hispaniensis , в то время как 67% были сопоставлены с геномом Y. rohdei , при этом ни одно из них не достигло геномного покрытия, превышающего 1x.

Напротив, когда мы проводили аналогичный анализ без применения стадии промежуточной промывки, поры не терялись после добавления вторичного образца (также добавленного через четыре часа). Данные собирали в общей сложности в течение восьми часов, в двух сериях, в которых сначала был секвенирован меньший F. hispaniensis , а затем более крупный Y.rohdei , и наоборот. Первый прогон сгенерировал 6038 проходов 2D-считываний, а второй — 71 618. Несмотря на большое расхождение в количестве произведенных считываний, относительная доля данных секвенирования, состоящих из организма, добавленного после четырех часов секвенирования, была столь же низкой. В первом прогоне, в котором первым был секвенирован F. hispaniensis , только 5,2% считываний в целом соответствовали геному Y. rohdei . В последнем прогоне, в котором первым был секвенирован Y. rodhei , число прочтений, соответствующих этому организму, составило 91.1% от общего числа прочтений, тогда как F. hispaniensis прочтений составили лишь 0,4%. Интересно, что в этом прогоне более 8% чтений не были сопоставлены. Многие из этих некартированных считываний могли соответствовать плазмиде F. hispaniensis pFSC454, которая не была доступна для сравнения в Refseq во время этого анализа.

Точность нативных штрих-кодов и штрих-кодов ПЦР в экспериментах 2D и 1D

Для прогонов 2D-ПЦР в среднем 8,4% считываний не были успешно демультиплексированы на основе их последовательности штрих-кода с дополнительным 0.1% этих считываний классифицируются как принадлежащие к штрих-кодам, которые не были включены в эксперимент. В исходных 2D-прогонах количество неклассифицированных чтений было ниже, чем наблюдавшееся в мультиплексированных прогонах ПЦР для начального эксперимента (3,3%), но увеличилось до 43% в более позднем прогоне, предполагая, что обновленный алгоритм демультиплексирования, примененный Программное обеспечение Albacore привело к исключению большего количества последовательностей из-за изменений в алгоритме обнаружения штрих-кода. Во всех прогонах считывания, которые были неправильно классифицированы как принадлежащие неиспользованному штрих-коду, были незначительными (0.02% и 0 соответственно). Эта повышенная строгость также наблюдалась при анализе 1D нативного прогона, где 35% считываний были неклассифицированными, и только 23 (<0,01%) были отнесены к несуществующему штрих-коду.

Большинство считываний, которые были успешно демультиплексированы, можно было сопоставить с правильным эталонным геномом. Однако в среднем было дополнительно 0,3% считываний в прогонах 2D-ПЦР со штрих-кодом, 0,8% для прогонов с нативным 2D-штрих-кодом и 1% в прогонах с нативным штрих-кодом 1D, которые были сопоставлены с геномом организма, с которым они были совместно секвенированные.

Выравнивание на основе картирования для определения статистики охвата и областей смещения

Покрытие в эталонном геноме было напрямую связано с количеством пройденных считываний, полученных при выполнении секвенирования (рис. 3). Мы не идентифицировали специфические геномные факторы, которые были связаны либо с увеличением, либо с уменьшением охвата и, следовательно, наводили на мысль о систематической ошибке при секвенировании, хотя, что интересно, данные Лаборатории 2 (L2) предполагали, что геномы изолятов были преимущественно секвенированы с коэффициентом охвата примерно 2: 1. при сравнении с любой из плазмид.

Коробчатая диаграмма, изображающая средний геномный охват, полученный для каждого из эталонных геномов, включенных в этот анализ. Последовательные организмы и соответствующие средние уровни покрытия для каждого окрашены, как описано.

Путем сравнения различных методов секвенирования (1D нативный, 2D ПЦР / нативное штрих-кодирование) мы определили, что профили ошибок сгенерированных данных секвенирования были одинаковыми для разных методов, с небольшим увеличением ошибки с методом ПЦР и повышенным частота ошибок при одномерном секвенировании (рис.4). Точность 2D-секвенирования была высокой, при этом выровненная базовая идентичность приближалась или превышала 97% для всех 2D-экспериментов. Точность выравнивания для 1D-секвенирования была ниже, чем для 2D-экспериментов, но, тем не менее, была выше 94%. Все уровни вставки, удаления и замены 1D были выше, чем в любом из выполненных экспериментов по кодированию 2D штрих-кодов. Размеры Indel варьировались в среднем от 1,5 до 1,85 пар оснований (п.н.), предполагая, что большинство ошибочных вызовов оснований было результатом пропущенных или добавленных одиночных оснований.В данных L2 ошибки были в основном вызваны инделками, связанными с гомополимерными растяжениями (дополнительный рис. 1). Такое же наблюдение не было сделано в данных, сгенерированных L1, предполагая, что качество эталона, используемого для анализа, важно для интерпретации вычислений частоты ошибок: в то время как образцы L1 имели полные геномы высокого качества, используемые в качестве эталона из NCBI, ссылки из L2 состояли из файл fasta, созданный на основе сборки de novo и полировки данных MinION с помощью данных MiSeq высокой глубины.

Характеристики ошибок данных, сгенерированных в различных прогонах секвенирования, включенных в этот анализ. ( A ) Доля оснований, точно совпадающая с отображенным сегментом ссылки. ( B ) Количество вставок на 100 выровненных оснований. ( C ) Удалений на 100 выровненных оснований. ( D ) Замены на 100 выровненных баз.

De novo сборки были успешно сгенерированы из наборов одномерных и двухмерных данных с использованием Canu.Когда для организмов, секвенированных с помощью L1, было получено среднее покрытие более 20, правильное количество контигов было идентифицировано во всех образцах. А именно, один большой контиг, выравнивающийся с хромосомой Y. rohdei , был обнаружен в образцах Y. rohdei , а два контига, включая последовательность хромосомы и совпадающую плазмиду, были обнаружены в F. hispaniensis . Размеры контигов сборки также были примерно сопоставимы с эталонными размерами. Однако для первого прогона 2D с собственным штрих-кодированием, выполненного L1, количество сгенерированных считываний не соответствовало 20-кратному порогу, рекомендованному для использования с Canu.В этом случае были сгенерированы большой контиг, который был короче ожидаемой длины хромосомы F. hispaniensis , и два небольших дополнительных контига. Для более крупного, Y. rohdei , геном вообще не мог быть сгенерирован, а самый большой контиг был создан всего лишь в 164 кб. Для прогона ПЦР со штрих-кодом из L2 ни один из включенных организмов не был секвенирован на достаточной глубине, чтобы можно было построить полный набор контигов. В этом прогоне самый большой контиг, сгенерированный для E.coli имел размер 839 т.п.н. и 62 т.п.н. для E. cloacae . Достаточная глубина была достигнута при секвенировании с использованием как 1D, так и 2D нативной химии для создания соответствующих геномных каркасов для каждого из организмов, при этом E. cloacae имеют хромосому длиной приблизительно 4,6 Мбит / с с одной плазмидой, а E. coli 4,7 Mbp с набором из трех дополнительных плазмидных последовательностей.

Требования к глубине секвенирования для одномерных наборов данных

Для оценки необходимого количества данных, необходимых для создания точных сборок de novo , при одновременном максимальном увеличении количества образцов, одновременно секвенируемых, особенно при использовании одномерной химии, последовательностей из прогона штрих-кодирования L1-1D-FAF18512-NAT были разрежены на разной глубине секвенирования с частотой ошибок сборки и точностью совмещения, оцениваемой на каждой итерации.Для меньшего генома (~ 1.9Mbp), F. hispaniensis , 10000 (10k) пройденных считываний теоретически было достаточно для получения одного контига, приближающегося к размеру генома, тогда как для Y. rohdei 20 k читаются как классифицированные как pass требовалось аналогичным образом для создания контигов соответствующего количества и размера (рис. 5). Интересно, что плазмида F. hispaniensis pFSC454 не была уверенно обнаружена в разрежении чтения 20 тыс., Что позволяет предположить, что наш случайный выбор чтения мог случайно отбросить чтения из этой структуры или что параметры сборки должны быть скорректированы в контексте прогонов с высоким охватом. для обнаружения плазмид.При сравнении точности этих сборок с точки зрения обнаруженных SNP и точек останова, необходимых для согласования со ссылками, контиги сохраняли ошибки даже при использовании 30 000 проходов чтения. Для сборок F. hispaniensis количество обнаруженных замен и отступов уменьшилось с итерации чтения 10k до итерации чтения 30k (173–99 замен и 9357–6988 вставок, соответственно). Однако важно отметить, что даже с полным набором данных были обнаружены ошибки подстановки и удаления при сравнении со ссылкой NCBI.Кроме того, на этих итерациях постоянно присутствовало шесть контрольных точек, что свидетельствует о крупномасштабных геномных перестройках, характерных для сгенерированных сборок, и о том, что они не могут быть смягчены увеличением глубины чтения. Для более крупного генома Y. rohdei примерно вдвое больше точек останова было обнаружено в итерации 10k по сравнению с 20k или 30k (420 против 262 и 266 соответственно). Были и масштабные вставки. Замены соответствовали примерно 18 тыс. На сборку, а отступы уменьшились с 43 тыс. В сборке 10 тыс. До чуть более 24 тыс. В сборке 30 тыс. (Дополнительная таблица 3).Когда применялось исправление ошибок с помощью Pilon ⁸ с MiSeq Nextera XT, ошибки SNP уменьшились, однако количество контрольных точек (представляющих неправильную сборку) не улучшилось ни для одного из организмов. FLYE, метод Abruijn ⁹ был оценен, чтобы определить, может ли он дать преимущество перед Canu в этом типе набора данных. Хотя этот метод был значительно быстрее, он не повлиял на качество сборки.

Характеристики сборки контигов, сгенерированных после подвыборки считываний fastq, сгенерированных с помощью одномерного секвенирования и нативного штрих-кодирования.Пунктирная линия — эталонный размер генома, указанный NCBI.

Влияние параметров обрезки качества на качество одномерных данных

В отличие от Metrichor / Epi2me и MinKNOW, чтения, вызываемые с помощью Albacore, автоматически не классифицируются как пройденные или неуспешные в рамках процесса базового вызова. Таким образом, чтобы оценить оптимальные условия обрезки для сборки de novo для прогона со штрих-кодом 1D MinION, эффект обрезки считываний на основе различных характеристик был оценен с использованием полного набора данных из L1-1D-FAF18512-NAT.Влияние загрязнения адаптера на сборку и данные считывания оценивали путем обрезки концов считывания на различных уровнях или применения Porechop ⁷ . Консервативное усечение считываний на 100 или менее консервативно на 50 пар оснований на любом конце или применение Porechop не оказало заметного влияния на частоту ошибок чтения или качество сборки с точки зрения сгенерированных контигов или обнаруженных вариантов. Следующим был оценен эффект применения отсечки различной длины и качества, при этом каждый из протестированных параметров приводил к исключению различных объемов данных.Более 10 тыс. (3%) считываний в изоляте Y. rohdei были исключены при минимальной длине 1000 оснований. Для образцов F. hispaniensis было удалено примерно 14 тыс. (7%) считываний. Также были оценены средние пороги качества чтения, равные 10 и 20, с удалением 58 и 77 последовательностей для Y. rohdei и F. hispaniensis соответственно при пороге качества 10 и 286 368 (72%) и 126 804 (62). %) при среднем качестве 20. Совместная фильтрация для качества> 20 и длины более 1000 оснований также была выполнена с 287 936 (73%) и 126 804 (63%), отфильтрованными из Y.rohdei и F. hispaniensis .

Интересно, что между любыми из этих методов фильтрации не было большой разницы между качеством данных секвенирования с точки зрения внесенных ошибок выравнивания. Точность сборки и охват (дополнительная таблица 3) по контигу также были одинаковыми для всех методов, вероятно, из-за значительного внутреннего скрининга, выполненного Canu перед генерацией контига. Использование нанополиша ¹⁰ уменьшило частоту дефектных ошибок, но было менее успешным в уменьшении больших перестановок и инверсий.Для данных F. hispaniensis все методы генерировали геномный контиг из приблизительно 1,95 млн пар оснований, согласующихся со справочными данными. Все они также генерировали второй контиг, относящийся к плазмиде pFSC454. Сборки этой плазмиды, сгенерированные каждым из методов, были длиннее, чем 16 тыс. Пар оснований, о которых сообщает NCBI (NZ_CP018094; 16 апреля 2017 г.), и составляли ~ 110 тыс. Пар оснований для обрезанного конца, фильтруя 63 тыс. Пар оснований, когда минимальное качество было установлено на 20 (включая итерация, когда качество и длина были отфильтрованы) и 38 тысяч базовых пар для остальных анализов.Для анализа Y. rohdei каждый из методов фильтрации генерировал большой контиг из 4,5 млн пар оснований. Интересно отметить, что для итераций, в которых использовался порог качественной фильтрации 20 и длина больше 1000, также были сгенерированы четыре дополнительных контига с длинами от 17 000 пар оснований до 40 000 пар оснований. Поиск BLAST идентифицировал их как часть генома F. hispaniensis , предполагая, что в образцах, которые в значительной степени отфильтрованы, вторичные контаминантные геномы из других одновременно обрабатываемых образцов, особенно с небольшими геномами, могут составлять достаточно значительную долю считываний для быть собранным.Охват для этих контигов был намного ниже, чем для целенаправленно секвенированного рассматриваемого генома (5x), что позволяет предположить, что применение порога охвата контигов могло бы смягчить сообщение о сборках контаминантов, когда в прогоне генерируется достаточное количество чтений.

Неправильная сборка, идентифицированная точками останова и инверсиями при сравнении контигов с эталоном, была обнаружена на всех итерациях и не улучшилась существенно при применении более надежных процедур скрининга или с использованием нанополистов (дополнительная таблица 3).Ни один метод фильтрации успешно не устранил все ошибки из контигов, что свидетельствует о том, что, несмотря на высокую степень охвата, достигнутую в этом эксперименте, он все еще был неэффективен для точной сборки геномов, или что есть ошибки в записях NCBI Refseq для этих организмов.

Оценка производительности быстрого набора MinION 1D перед развертыванием

Большинство считываний, полученных при быстром 1D-секвенировании, были произведены в первые 16 часов секвенирования.Однако большинство из них были классифицированы MinKNOW как неудачные или пропущенные (базовый вызов не выполнялся) (рис. 1). Среднее качество пройденных чтений MinKNOW для прогона F. hispaniensis составляло 10. Из чтений, которые были пропущены MinKNOW в прогоне F. hispaniensis , 5839 из 7532 были успешно определены с использованием albacore, а данные fastq были извлечены с помощью инструментов poretools. . Однако они имели более низкое медианное качество (5.5, настройки по умолчанию для инструментов poretools), чем считывания секвенирования, которые были классифицированы устройством MinKNOW как пройденные.Когда фильтрация на основе длины была отключена, среднее качество пропущенных считываний составляло 6. Обзвон считываний, пропущенных MinKNOW, также существенно увеличивал время цикла анализа, при этом этот этап требовал дополнительных 15 часов времени обработки. По этой причине было решено, что последующие эксперименты будут сосредоточены только на базе данных, которая была классифицирована MinKNOW как проходная. Среднее качество проходящих считываний серии Y.rohdei составляло 9. Примечательно, что свежеприготовленная ДНК не использовалась для этой серии экспериментов, что потенциально объясняет уменьшенное количество сгенерированных считываний.

, классифицированные как проходящие в этом эксперименте, впоследствии сравнивали с геномами F. hispaniensis (NZ CP018093.1) и Y.rohdei (NZ CP009787.1) с использованием NanoOK (Таблица 1). Качество чтения и согласованная базовая идентичность были ниже, чем описанные ранее для одномерных данных. Чтобы оценить нашу способность правильно идентифицировать патогены, несмотря на это снижение качества, мы выполнили последовательность fastqs через kraken на настольном компьютере с 48 ядрами 2,30 ГГц.1277 последовательностей из серии F. hispaniensis были обработаны за 1241,935 с. 1077 (84,34%) были классифицированы правильно, а 200 (15,66%) были неклассифицированными, ошибочными или не отнесенными ниже уровня семьи. Для анализа Y.rohdei 5044 последовательности были обработаны за 1680,814 с. Из них 4279 (84,83%) были классифицированы, а 765 (15,17%) были неклассифицированными, ошибочными или не отнесенными ниже уровня семьи. Мы также оценили влияние фильтрации качества чтения на пройденные чтения, применив среднее значение q-score, равное 8, чтобы определить, повлияло ли это на способность классифицировать чтения по соответствующей таксономической группе.Когда мы применили этот фильтр к данным F. hispaniensis , 1043 последовательности превзошли этот порог, из которых 97,03% были правильно классифицированы на уровне рода. Для Y. rohdei 4105 последовательностей превысили этот порог, 94,91% которых были классифицированы соответствующим образом (род). Результаты этих экспериментов были использованы для принятия решений в анализах, проводимых вне лаборатории.

Метрики секвенирования данных, сгенерированных удаленно

Первый образец, состоящий из «чистой» геномной ДНК штамма B. anthracis Vollum (1,3 нг / мкл; 6,5 нг секвенирован), был секвенирован в общей сложности в течение пяти часов и сгенерирован большой объем меньше данных, чем это типично для серий секвенирования, проводимых в идеальных экспериментальных условиях (таблица 2). Второй образец, мазок в TE, в котором 5 мкл смеси B. anthracis (3,3 нг) и контрольной геномной ДНК человека (5 мкг), дал гораздо больше данных (таблица 2).Для секвенирования Образца 2 добавление второго препарата библиотеки к той же проточной ячейке через один час после начала секвенирования привело к генерированию сопоставимого количества данных последовательности с выходными данными, полученными в результате небыстрого тестирования набора, после 23 часов работы. Примечательно, что для этих экспериментов использовались концентрации ДНК значительно ниже 27 нг / мкл, рекомендованных ONT. Несмотря на эту проблему, для обоих прогонов примерно через час было доступно достаточное количество данных о последовательности, чтобы можно было провести анализ.

Идентификация патогенов и возможность биологической сортировки

Чтобы полностью оценить возможности MinION для биологической сортировки, было использовано несколько инструментов для таксономического распределения считываний секвенирования для повышения уверенности в идентификации. В первом образце в T1 78,4% считываний были отнесены кракеном к группе B. cereus , а 20.27% отнесены к B. anthracis и еще 8% отнесены к B. cereus или B. thuringensis . На уровне рода 88,5% считываний были классифицированы как Bacillus, а остальные — неклассифицированными. Эти пропорции были применены к окончательному анализу (Т-финал) в этом образце. Анализ сигнатурной последовательности в точке T1 показал, что две последовательности отображаются в последовательности геномной сигнатуры, а 103 — в pXO1 или pXO2. На Т-финале этот образец имел 18 последовательностей, отображаемых на четыре последовательности геномных сигнатур, и еще 418 последовательностей, отображаемых на pXO1 и pXO2.Анализ данных с помощью MASH ¹¹ (T1 и T-final) обеспечил лучшие совпадения, соответствующие плазмиде pXO1 из B. anthracis и геному B. anthracis . Взятые вместе, эти данные показывают, что мы можем точно идентифицировать B. anthracis в чистом образце с низкой концентрацией через один час после начала секвенирования с использованием технологии MinION — момент времени, эквивалентный традиционной ПЦР в реальном времени.

В момент T1 второй образец содержал примерно 83% классифицированных последовательностей.Подавляющее большинство (81,2%) соответствовало Homo sapiens . На данный момент только два чтения были успешно названы как B. anthracis , а 12 (1,1%) были идентифицированы как Escherichia coli . Учитывая, что эта выборка представляла смешанное сообщество, MASH не использовался для анализа. Анализ сигнатурной последовательности в точке T1 не выявил B. anthracis. Картирование считываний на нашем пороговом уровне оценки качества картирования (50), однако, когда пороговое значение не использовалось, было обнаружено одно сопоставление считывания с геномной подписью и одно считывание с плазмидой pXO1. .Таким образом, была подготовлена ​​дополнительная библиотека и добавлена ​​в проточную ячейку, чтобы определить, действительно ли этот образец был положительным для B. anthracis . После прохождения дополнительных 23 часов 14,5% последовательностей оказались неклассифицированными, и большинство из них были классифицированы как H. sapiens (83,94%). Тринадцать прочтений были идентифицированы как члены группы B. cereus , и только три соответствовали B. anthracis . Остальные чтения были классифицированы как E. coli (27; 0.47%). Анализ сигнатурной последовательности выявил три считывания, которые с высокой степенью достоверности (оценка> 50) сопоставлены с pXO1 или pXO2. Когда порог качества не применялся, было успешно картировано 168 считываний, причем большинство 98,2% картировались с любой плазмидой.

Границы | MinION: новый инструмент для прогнозирования гиперчувствительности к лекарствам?

Введение

Запуск программы MinION Access от Oxford Nanopore Technologies (ONT), британской компании, специализирующейся на секвенировании нанопор, вызвал большую активность в научном сообществе.Устройство представляет собой миниатюрный секвенатор третьего поколения, в котором размещено 512 нанопор, отвечающих за обнаружение одноцепочечных ДНК. Благодаря постоянному повышению точности секвенирования MinION стал долгожданным дополнением к множеству инструментов, используемых для диагностики наследственной лекарственной гиперчувствительности. Компактные размеры устройства придают ему такую ​​портативность, которую не могут превзойти другие платформы. Было даже предположение, что MinION может быть доставлен на Марс и использован для исследования существования инопланетных форм жизни (Check Hayden, 2015).До сих пор использование MinION было направлено в основном на секвенирование ДНК; однако изучается более широкий спектр приложений MinION для анализа РНК, микроРНК и белков. Увеличенная версия MinION, состоящая из 48 проточных ячеек и обозначенная как PromethION, также стала доступной через другую программу, предоставляя участникам ранний доступ к платформе (Karow, 2015).

MinION: История и приложения

Характеристики ионных каналов как нанопор для обнаружения молекул ДНК широко исследуются два десятилетия назад (Kasianowicz et al., 1996; Ховорка и др., 2001). После очистки одноцепочечные ДНК проходят через массив пор, встроенных в мембрану, и образуются характерные паттерны тока, отражающие идентичность оснований ДНК (Clarke et al., 2009; Ip et al., 2015). Различные улучшения экспериментальной установки повысили точность считывания основания; они включали модификацию структуры каналов α-гемолизина, добавление объемных молекул циклодекстрина для уменьшения скорости перемещения ДНК через поры, введение шпилечных полинуклеотидов для соединения разархивированных двухцепочечных ДНК и регулирование концентраций солей в буфере. для изменения напряжения на мембране (Clarke et al., 2009; Brown et al., 2012). Эти изменения в конечном итоге привели к выпуску MinION. По сравнению с существующими секвенаторами второго поколения, такими как MiSeq и Ion Torrent с последовательностью до 400 п.н., MinION считается идеальным для секвенирования ДНК, поскольку он может генерировать длинные чтения до или более 50 кб (Jain et al., 2015). Более того, он не требует предварительной амплификации образца, что устраняет потенциальную систематическую ошибку в данных, которая может быть внесена в результате полимеразной цепной реакции (ПЦР).

MinION был протестирован в различных приложениях, от ранних работ по секвенированию и идентификации бактерий до недавнего открытия его способности обнаруживать патогены в плазме человека и отличать метилированные основания ДНК от их неметилированных аналогов (рис. 1).Расширенные последовательности, сгенерированные MinION, были использованы для дополнения данных более высокого качества MiSeq при построении геномов Bacteroides fragilis и Saccharomyces cerevisiae (Goodwin et al., 2015; Risse et al., 2015). Дальнейшее совершенствование рабочего процесса биоинформатики позволило осуществить сборку генома de novo для штамма Escherichia coli K-12 MG1655, в результате чего нуклеотидная точность 98,4% была отмечена в реконструированном геноме размером 4,6 мб (Loman et al., 2015).Такие высококачественные данные, полученные с помощью устройства, позже были преобразованы в дифференциацию трех близкородственных поксвирусов, а именно коровьей оспы, коровьей оспы-MVA и коровьей оспы-Lister (Kilianski et al., 2015). Портативность MinION и относительно быстрая подготовка проб и генерация данных, связанные с секвенатором, сделали его полезным инструментом в недавней эпидемии Эболы, когда он использовался на месте для мониторинга эволюции вируса Эбола в серии клинических образцов. . Подобные принципы идентификации вирусов в крови человека также применялись для секвенирования вирусов чикунгуньи и гепатита С (Greninger et al., 2015; Quick et al., 2016).

РИСУНОК 1. Приложения MinION представлены в хронологическом порядке.

При обнаружении паттернов метилирования ДНК в образцах человека тонкие различия в электрических сигналах, производимых метилированными цитозиновыми основаниями, также могут быть уловлены MinION (Simpson et al., 2016). Это захватывающий прорыв, поскольку обычная идентификация этих молекулярных модификаций требует более сложного и специализированного подхода к подготовке образцов, такого как иммунопреципитация метилированной ДНК с последующим секвенированием или бисульфитное геномное секвенирование (Frommer et al., 1992; Corley et al., 2015). Бисульфитное секвенирование, золотой стандарт для обнаружения метилирования ДНК, косвенно позволяет дифференцировать метилированные цитозины посредством селективного превращения неметилированных цитозинов в урацилы, которые затем обнаруживаются как тимин после -ПЦР (Li and Tollefsbol, 2011). Напротив, рабочий процесс на основе MinION намного проще: статистическая модель была разработана и оптимизирована для прямой идентификации 5-метилцитозина из образцов, подготовленных по стандартному протоколу ONT (Simpson et al., 2016). Хотя прямой причинно-следственной связи между лекарственной гиперчувствительностью и метилированием ДНК не наблюдалось, было доказано, что эпигенетический феномен опосредует другие процессы, такие как патогенез заболевания и эффективность ряда лекарств (Beyrouthy et al., 2009; Anier et al. , 2010).

Обработка данных секвенирования нанопор

Центральное место в обработке данных секвенирования нанопор занимает скрытая марковская модель (Eddy, 2004), которая применялась на различных этапах анализа последовательности от определения оснований, точной настройки выравнивания до открытия вариантов (Jain et al., 2015; Салай, Головченко, 2015). Для базового вызова эта модель дает статистические выводы о лежащих в основе последовательностях ДНК (скрытое состояние) на основе серии из переданных наблюдений. Последовательные ионные возмущения (события), вызванные 6-мерными ДНК (или 5-мерными ДНК для устаревших рабочих процессов), которые проходят через нанопоры, преобразуются в последовательности ДНК на основе известных пар секстетов ДНК и соответствующих текущих значений (Timp et al. др., 2012; Салай, Головченко, 2015).Основным препятствием для этого подхода является то, что текущие уровни для всех возможных 6-мерных комбинаций составляют континуум электрических сигналов, а не разделяются на дискретные паттерны, которые можно однозначно интерпретировать. Чтобы выявить эти ионные сигнатуры, дополнительные ключи получают из соседних последовательностей (Timp et al., 2012). Например, предположим, что мы должны были сделать вывод о 6-мерной ДНК из электрического сигнала, что указывало на две возможности: TACGTA и TACGTT. Мы знали, что в большинстве случаев предыдущая последовательность, ATACGT, скорее всего, переходила в TACGTA; таким образом, TACGTA должен был быть мотивом последовательности, из которого произошел сигнал (Timp et al., 2012). Хотя этот пример довольно упрощен, он служит для иллюстрации эффективности модели Маркова. Вероятности выбросов и перехода могут быть получены из наборов данных, которые используются для обучения модели.

Аналогичным образом, для выравнивания последовательностей оценок максимального правдоподобия могут быть вычислены для всех типов ошибок секвенирования нанопор в сети Маркова, то есть вставок, делеций и замен. Эти оценки затем используются, чтобы удостовериться, действительно ли несогласованное считывание смещено.Например, поскольку ошибочные вызовы A – T или T – A маловероятны, выравнивания последовательностей, содержащие эти несовпадения, вполне могли быть размещены неправильно. С другой стороны, выравниватель может быть не виноват, и расхождения могут возникать из-за присущих вариаций ДНК (Jain et al., 2015). Эта стратегия была экстраполирована для улучшения выравнивания, генерируемого существующими выравнивателями, и последующего обнаружения вариантов, намеренно введенных в эталонный геном фага (Jain et al., 2015).

Пример конвейера биоинформатики для данных, генерируемых MinION, показан на рисунке 2.Исходные электрические сигналы могут быть вызваны с помощью инструмента, предоставляемого ONT, Metrichor или другим программным обеспечением с открытым исходным кодом (Boža et al., 2016; David et al., 2016). Последовательности ДНК, полученные из нанопор, хранятся в формате FAST5 вместе с другими типами данных, такими как статистика прогона. Все данные стратифицированы и помещены в заранее определенные категории. Обработка перед выравниванием обычно требует извлечения последовательностей FASTA или FASTQ из файлов FAST5 с помощью Poretools (на основе Python; Loman and Quinlan, 2014) или poRe (написано на R; Watson et al., 2015). К настоящему времени был протестирован ряд выравнивателей с длинным считыванием на последовательностях нанопор, включая BLASR, BWA-MEM, LASTZ и LAST. Одна из проблем, уникальных для выравнивания с длинным считыванием, заключается в быстром нахождении коротких совпадений, называемых семенами или якорями , между двумя последовательностями во время предварительного цикла выравнивания (Li and Durbin, 2009; Chaisson and Tesler, 2012; Li, 2013). Для более длинных последовательностей количество возможных совпадений и несовпадений больше; следовательно, на работу выравнивателей в большей степени повлияет эффективность их алгоритма «затравка и расширение» .

РИСУНОК 2. Пример конвейера для обработки данных MinION (A), (B – D) вместе с дополнительными примечаниями для соответствующих концепций, связанных с биоинформатикой.

BLASR и BWA-MEM сначала вызывают преобразование Burrow-Wheelers для создания легко доступных для поиска, отсортированных строк (индекса) эталонного генома, чтобы облегчить начальную параллельную проверку, которая определяет короткие точных совпадений , которые впоследствии расширяются или усовершенствованы с образованием более длинных участков ДНК (Chaisson and Tesler, 2012; Li, 2013).LASTZ похож на BLASR и BWA-MEM, но с двумя основными вариациями. Во-первых, выравниватель использует другой механизм индексации и разбивает контрольную последовательность на перекрывающиеся сегменты одинакового размера, чтобы облегчить сравнение последовательностей. Во-вторых, не требуется абсолютного сходства для квалификации короткого матча как приемлемого начального числа; допускается некоторая степень несоответствия (Harris, 2007). LAST отличается от LASTZ тем, что он может более успешно разрешать богатые повторами последовательности (Kiełbasa et al., 2011). После выравнивания последовательности могут быть дополнительно исследованы с помощью NanoOK, который определяет распределение длин чтения, наличие k-мер, глубину охвата по целям и другую важную статистику (Leggett et al., 2015). После точного совмещения можно сгенерировать вызовы вариантов ДНК с высокой степенью достоверности.

Фармакогенетика: классический случай гиперчувствительности к абакавиру

Абакавир, нуклеозидный ингибитор обратной транскриптазы, используемый для лечения ВИЧ-1-инфекции, вызывает потенциально смертельную реакцию гиперчувствительности, к которой особенно чувствительны европейцы, у 4–9% лиц, подвергшихся воздействию препарата (Hetherington et al., 2002; Маллал и др., 2002; Симондс и др., 2002; Мартин и др., 2004).На сегодняшний день гиперчувствительность, вызванная абакавиром, остается одним из немногих обнадеживающих примеров терапии, управляемой фармакогенетикой. Генетическая предрасположенность, в частности наличие аллеля HLA-B ^∗ 57:01 (лейкоцитарный антиген человека), является сильным предиктором гиперчувствительности к абакавиру. Связь, впервые описанная в популяции Западной Австралии (Mallal et al., 2002), с тех пор была воспроизведена во многих других исследованиях (Hetherington et al., 2002; Hughes et al., 2004a; Rauch et al., 2006; Родригес-Новоа и др., 2007; Waters et al., 2007; Zucman et al., 2007; Маллал и др., 2008). Аллель HLA-B ^∗ 57:01 имеет высокую степень пенетрантности; объединенное отношение шансов из трех исследований было рассчитано равным 29. Тем не менее, не все носители HLA-B ^∗ 57:01 будут гиперчувствительны к абакавиру; из каждых десяти человек, несущих аллель, только у пяти действительно разовьется реакция (Hetherington et al., 2002; Mallal et al., 2002; Hughes et al., 2004а). Вероятно, что другие локусы или пути гена, особенно те, которые участвуют в превращении абакавира в аллергенные метаболиты, также внесли свой вклад в патогенез гиперчувствительности к абакавиру (Martin et al., 2004, 2012).

Скрининг на предмет носительства HLA-B ^∗ 57:01 и использование этой информации для предотвращения приема абакавира у восприимчивых людей, существенно снизило частоту гиперчувствительности к абакавиру, тем самым уменьшив расходы, которые были бы понесены при лечении этих заболеваний. реакции (Hughes et al., 2004a; Schackman et al., 2008). Снижение частоты реакций гиперчувствительности варьировалось от двукратного (Waters et al., 2007; Mallal et al., 2008) до четырехкратного (Rauch et al., 2006) до полного искоренения (Zucman et al., 2007). ). Рентабельность тестирования HLA-B ^∗ 57:01 зависит от этнической принадлежности и является наибольшей среди всех европеоидов или преимущественно европеоидов. Лица другого этнического происхождения, например африканцы (Hetherington et al., 2002; Hughes et al., 2004b) и тайваньцы (Sun et al., 2007) извлекают мало пользы из такой дискриминационной стратегии. Риск развития гиперчувствительности к абакавиру значительно ниже в обеих популяциях (Symonds et al., 2002; Sun et al., 2007). Например, частота гиперчувствительности, вызванной абакавиром, составляет только 0,9% среди тайваньцев, что совпадает с их столь же редким носителем аллеля HLA-B ^∗ 57:01 (0,3% по сравнению с примерно 8% у белых; Rauch et al. др., 2006; Сан и др., 2007). Несмотря на очевидное влияние индивидуального этнического происхождения, Консорциум по внедрению клинической фармакогенетики рекомендовал скрининг HLA-B ^∗ 57:01 для всех пациентов, прежде чем им назначат абакавир (Martin et al., 2012, 2014). Отличить аллели HLA может быть непросто, поскольку эти аллели могут различаться только в нескольких положениях в пределах своего второго и третьего экзонов (Robinson et al., 2015).

Использование устройства MinION для определения генотипа

Существует несколько вариантов тестирования для скрининга HLA-B ^∗ 57:01 , при этом методы, основанные на последовательностях, являются наиболее технически сложными и считаются непригодными для рутинного использования (Martin et al., 2012). Эти методы часто основаны на ПЦР для обогащения желаемых областей HLA (Carapito et al., 2016). В специально разработанном конвейере на основе ПЦР (Ammar et al., 2015) области HLA-A и HLA-B были амплифицированы в двух ПЦР дальнего действия, и полученные продукты (~ 4 т.п.н. каждый) были секвенированы. на Миньоне. Точность считывания нанопор была ожидаемо низкой: доля эталонно-дискордантных оснований приближалась к 30%. Авторы предположили, что это могло отрицательно повлиять на результаты генотипирования: оба образца, испытанные с помощью этого метода, были типизированы ошибочно.Возможность того, что гаплотипы HLA могут быть скрыты путем ПЦР-рекомбинации или химеризма , упоминалась, но не обсуждалась подробно (Ammar et al., 2015; Laver et al., 2016).

Кроссинговер удлинение или переключение матрицы — хорошо известный артефакт ПЦР, посредством которого неполностью синтезированные продукты ПЦР (мегапраймеры) отжигаются с новыми матрицами, давая начало химерным аллелям (Odelberg et al., 1995). Рекомбинированные аллели могут затруднить интерпретацию гаплотипа, и стоит отметить, что такие ошибки клинически значимы и могут снизить эффективность MinION-ориентированных подходов для генотипирования HLA .Например, в случае характеристики гена BCR-ABL1 при хроническом миелоидном лейкозе было обнаружено, что возникновение рекомбинации ПЦР создает искусственные мутации соединения BCR-ABL1 , потенциально вводящие в заблуждение противораковую терапию. После двух раундов ПЦР, всего 80 циклов, было отмечено, что почти 50% ампликонов являются химерными (Parker et al., 2014).

В протокол PCR можно внести несколько изменений, чтобы ослабить переключение шаблонов. Например, время продления может быть увеличено для обеспечения полного синтеза продуктов ПЦР в каждом цикле; или количество циклов ПЦР, сокращенных для уменьшения вероятности рекомбинации ПЦР (McDonald et al., 2002; Laver et al., 2016). Кроссинговер с большей вероятностью произойдет ближе к концу цикла ПЦР или после многочисленных раундов удлинения, во время которых синтезированные продукты наиболее сконцентрированы. В качестве альтернативы можно было бы принять другой механизм обогащения, чтобы избежать этих изменений. Короткие комплементарные олигонуклеотиды, действующие как зонды , могут эффективно захватывать целевых областей HLA из пула геномных ДНК, которые были обрезаны до предварительно определенного диапазона размеров (Wittig et al., 2015). Для MinION может потребоваться выбрать более длинные зонды (Karamitros and Magiorkinis, 2015) и гораздо менее строгий протокол фрагментации ДНК, чтобы сохранить способность устройства производить очень длинные считывания для сборки крупномасштабных гаплотипов. .

В настоящее время более серьезную озабоченность по поводу MinION вызывает, возможно, его низкая точность базового вызова; частота ошибок часто оценивается выше 10% (Check Hayden, 2015). Предыдущие попытки преодоления этой проблемы касались в основном двух аспектов рабочего процесса секвенирования: преобразование входных ДНК в шаблоны, допускающие секвенирование; и перевод ионных событий в основания ДНК.Первая тактика извлекает выгоду из избыточного секвенирования в том, что входная ДНК циркулирует и амплифицируется сегментарно (амплификация по вращающемуся кругу) для создания тандемных копий (≥6) сегмента для определения консенсусной последовательности (Li et al., 2016). Это привело к значительному повышению точности считывания (> 97%), приближающемуся к точности, достигаемой платформами второго поколения (Quail et al., 2012). Однако стоимость такой повышенной точности заключается в уменьшении чистого вывода от MinION; другими словами, за один прогон в конечном итоге создается меньше баз.Вторая тактика основана на статистическом обучении, усиленном быстро расширяющимися наборами данных MinION, которые находятся в открытом доступе. Это позволило построить зрелые скрытые марковские модели для базового вызова, установив более точные шаблоны перехода от события к последовательности. Построение сложной искусственной нейронной сети для определения последовательности ДНК также было предложено в качестве решения загадки (Jain et al., 2015; Boža et al., 2016; David et al., 2016). В настоящее время неясно, какая из двух стратегий лучше: модифицированная подготовка шаблона, которая добавляет некоторую степень сложности, или лучше обученные алгоритмы in silico ?

Относительно трудоемкий характер типирования на основе последовательностей HLA представляет собой еще одно ограничение, которое необходимо преодолеть, чтобы обеспечить рутинное использование метода.Например, нередко цикл секвенирования MinION занимает один день, хотя можно проанализировать данные до завершения цикла. Требование амплификации с помощью ПЦР с длинным диапазоном для выделения генов HLA может легко продлить процедуру до двух дней. Для синтеза длинных ампликонов длительное время элонгации является неизбежным узким местом; Обычно для полимеризации ~ 1000 нуклеотидов требуется 30–60 с. Протокол на основе зондов может потребовать еще более длительного времени — 3–4 дня; но он предлагает преимущество искоренения химеризма ПЦР, поскольку для обогащения захваченных фрагментов требуется всего 18 циклов амплификации (Karamitros and Magiorkinis, 2015; Laver et al., 2016). С другой стороны, протокол ускоренной длинной ПЦР может быть составлен из следующих ингредиентов: ПЦР цельной крови, исключающей необходимость экстракции ДНК (Mercier et al., 1990), сверхбыстрая ПЦР с возможностью быстрого переключения температуры (Wheeler et al., 1990). al., 2011), и высокопроцессивные полимеразы Taq , способные быстрее включать нуклеотиды (Böhlke et al., 2000).

Заключение

Как мы уже отмечали, несколько вопросов требуют обсуждения, прежде чем типирование HLA на основе MinION можно будет рассматривать для клинического использования.Неудовлетворительная точность данных по-прежнему остается нерешенной проблемой. Было показано, что модифицированный подготовительный протокол, который объединяет информацию о последовательности из тандемных копий сегмента ДНК, повышает точность определения оснований (Li et al., 2016). Возможно, стоит сравнить производительность этого метода с другими подходами in silico . Время выполнения тестов, основанных на последовательностях, должно быть значительно сокращено; Кроме того, процесс тестирования должен быть дополнен оптимизированным механизмом анализа, интерпретации и отчетности данных.Spartan RX, панель, предназначенная для идентификации слабых метаболизаторов CYP2C19, может дать требуемый результат в течение 1 часа после сбора образца (Spartan Bioscience Inc., 2016). Прежде всего, реальная полезность тестов на основе последовательностей вызывает вопрос о том, достаточен ли уровень разрешения генотипа HLA , достигаемый другими более быстрыми и менее трудоемкими методами, такими как аллель-специфическая ПЦР, в клинических условиях (Мартин и др., 2012). Несмотря на эти неопределенности, разнообразная полезность MinION очевидна в ассортименте приложений, на которых он был протестирован.Мы надеемся, что MinION в конечном итоге станет мощным инструментом для диагностики лекарственной гиперчувствительности.

Авторские взносы

Все перечисленные авторы внесли существенный, прямой и интеллектуальный вклад в работу и одобрили ее для публикации.

Заявление о конфликте интересов

Авторы заявляют, что исследование проводилось при отсутствии каких-либо коммерческих или финансовых отношений, которые могут быть истолкованы как потенциальный конфликт интересов.

Список литературы

Аммар Р., Патон Т. А., Торти Д., Шлиен А. и Бадер Г. Д. (2015). Секвенирование нанопор с длинным считыванием для обнаружения вариантов и гаплотипов HLA и CYP2D6 . F1000Res. 4:17. DOI: 10.12688 / f1000research.6037.1

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Аниер, К., Малиновская, К., Аонурм-Хельм, А., Жарковский, А., Калда, А. (2010). Метилирование ДНК регулирует индуцированную кокаином поведенческую сенсибилизацию у мышей. Нейропсихофармакология 35, 2450–2461. DOI: 10.1038 / npp.2010.128

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Бейрути М.Дж., Гарнер К.М., Хевер М.П., ​​Фримантл С.Дж., Истман А., Дмитровский Э. и др. (2009). Высокая экспрессия ДНК-метилтрансферазы 3B опосредует гиперчувствительность к 5-аза-дезоксицитидину в опухолях половых клеток яичек. Cancer Res. 69, 9360–9366. DOI: 10.1158 / 0008-5472.CAN-09-1490

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Бёльке, К., Пизани, Ф. М., Воргиас, К. Э., Фрей, Б., Собек, Х., Росси, М. и др. (2000). Характеристики ПЦР ДНК-полимеразы B-типа из термофильного euryarchaeon Thermococcus aggregans улучшены за счет мутаций в мотиве Y-GG / A. Nucleic Acids Res. 28, 3910–3917. DOI: 10.1093 / nar / 28.20.3910

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Божа, В., Брейова, Б., и Винерж, Т. (2016). DeepNano: глубокие рекуррентные нейронные сети для базового вызова в чтениях нанопор MinION. arXiv : 1603.09195.

Google Scholar

Браун, К. Г., Кларк, Дж. А., и Херон, А. Дж. (2012). Метод петли шпильки для секвенирования двухцепочечных полинуклеотидов с использованием трансмембранных пор. Патент США № 14/234 698. Вашингтон, округ Колумбия: Бюро по патентам и товарным знакам США.

Карапито, Р., Радосавлевич, М., и Бахрам, С. (2016). Секвенирование локуса HLA следующего поколения: методы и влияние на типирование HLA, популяционная генетика и исследования ассоциации заболеваний. Hum. Иммунол. DOI: 10.1016 / j.humimm.2016.04.002.

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Chaisson, M. J., и Tesler, G. (2012). Картирование считываний секвенирования отдельных молекул с использованием базового локального выравнивания с последовательным уточнением (BLASR): применение и теория. BMC Bioinformatics 13: 238. DOI: 10.1186 / 1471-2105-13-238

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Кларк, Дж., Ву, Х. К., Джаясингхе, Л., Патель, А., Рид, С., и Бейли, Х. (2009). Непрерывная идентификация оснований для секвенирования одномолекулярных нанопор ДНК. Нат. Nanotechnol. 4, 265–270. DOI: 10.1038 / nnano.2009.12

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Корли, М. Дж., Чжан, В., Чжэн, X., Лам-Джонс, А., и Маунакеа, А. К. (2015). Полупроводниковое секвенирование состояний метилирования ДНК по всему геному. Эпигенетика 10, 153–166. DOI: 10.1080 / 15592294.2014.1003747

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Дэвид, М., Дурси, Л. Дж., Яо, Д., Бутрос, П. К., и Симпсон, Дж. Т. (2016). Nanocall: программа с открытым исходным кодом для определения последовательности оксфордских нанопор. bioRxiv 1: 46086.

Google Scholar

Фроммер М., Макдональд Л. Э., Миллар Д. С., Коллис К. М., Ватт Ф., Григг Г. В. и др. (1992). Протокол геномного секвенирования, который дает положительное отображение остатков 5-метилцитозина в отдельных цепях ДНК. Proc. Natl. Акад. Sci. США . 89, 1827–1831. DOI: 10.1073 / пнас.89.5.1827

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar