Зрелые на природе: Порно зрелые на природе: смотреть 1000 видео онлайн

1. Briggs, R., and King, T. J., J. Exp. Зоол. , 122 , 485 (1953).

   Артикул Google ученый

2. Кинг Т.Дж. и Бриггс Р., 9 лет0008 Симптом в Колд-Спринг-Харбор. , 21 , 271 (1956).

   Артикул КАС Google ученый

3. Элсдейл Т.Р., Фишберг М. и Смит С., Exp. Сотовый рез. (в печати).

4. Nieuwkoop, P.D., and Faber, J., «Нормальная таблица Xenopus laevis» (1956).

   Google ученый

Скачать ссылки

Author information

Authors and Affiliations

1. Department of Zoology and Comparative Anatomy, University Museum, Oxford

   J. B. GURDON, T. R. ELSDALE & M. FISCHBERG

Authors

1. J. B. GURDON

   View author publications

   Вы также можете искать этого автора в PubMed Google Scholar

2. T. R. ELSDALE

   Просмотр публикаций автора

   Вы также можете искать этого автора в PubMed Google Академия

3. M. FISCHBERG

   Просмотр публикаций автора

   Вы также можете искать этого автора в PubMed Google Scholar

Права и разрешения

Перепечатка и разрешения

Об этой статье

Эта статья цитируется

• Здоровое клонированное потомство, полученное из лиофилизированных соматических клеток.

  • Саяка Вакаяма
  • Дайю Ито
  • Терухико Вакаяма

  Nature Communications (2022)

• Сравнительный параллельный мультиомический анализ при индукции плюрипотентного и трофэктодермального состояний

  • Мохаммад Джабер
  • Ахмед Радван
  • Йосеф Буганим

  Nature Communications (2022)

• Клеточное перепрограммирование и эпигенетическое омоложение

  • Дэниел Дж. Симпсон
  • Нелли Н. Олова
  • Тамир Чандра

  Клиническая эпигенетика (2021)

• hiPSCs для прогностического моделирования нейродегенеративных заболеваний: мечтая о возможном

  • Пиа Риветти ди Валь Черво
  • Дарио Бесуссо
  • Елена Каттанео

  Nature Reviews Неврология (2021)

• Вывод относительных пропорций ткани эпителиальных клеток молочной железы типов просветных предшественников, базальных и просветных зрелых

  • Томас Э. Бартлетт
  • Пейвэнь Цзя
  • Сандипан Рой

  Научные отчеты (2021)

Комментарии

Отправляя комментарий, вы соглашаетесь соблюдать наши Условия и Правила сообщества. Если вы обнаружите что-то оскорбительное или не соответствующее нашим условиям или правилам, отметьте это как неприемлемое.

Генерация зрелых Т-клеток из гемопоэтических стволовых клеток человека и клеток-предшественников в искусственных органоидах тимуса

Abstract

Для изучения развития Т-клеток человека требуются надежные модельные системы, которые резюмируют весь спектр тимопоэза, от гемопоэтических стволовых клеток и клеток-предшественников (HSPC) до к зрелым Т-клеткам. Существующие модели in vitro индуцируют коммитирование Т-клеток из человеческих HSPC; однако дифференцировка в зрелые CD3 ⁺ TCR-αβ ⁺ однократно положительные клетки CD8 ⁺ или CD4 ⁺ ограничена. Мы описываем здесь бессывороточную систему искусственных органоидов тимуса (АТО), которая поддерживает эффективную и воспроизводимую дифференцировку in vitro и положительный отбор обычных Т-клеток человека из всех источников HSPC. Т-клетки, полученные из АТО, демонстрировали зрелые наивные фенотипы, разнообразный репертуар Т-клеточных рецепторов (TCR) и TCR-зависимую функцию. АТО, инициированные с помощью HSPC, сконструированных с помощью TCR, продуцировали Т-клетки с антигенспецифической цитотоксичностью и почти полным отсутствием эндогенной экспрессии TCR Vβ, что согласуется с аллельным исключением локусов, кодирующих Vβ. ATO обеспечивают надежный инструмент для изучения дифференцировки Т-клеток человека и для будущей разработки методов лечения Т-клеток на основе стволовых клеток.

Это предварительный просмотр содержимого подписки, доступ через ваше учреждение

Соответствующие статьи

Статьи открытого доступа со ссылками на эту статью.

• Скрытый сплайсинг лентивектора опосредует увеличение клонов CD34+, экспрессирующих укороченный HMGA2, при Х-сцепленном тяжелом комбинированном иммунодефиците человека

  • Сук Си Де Равин
  • , Сиюань Лю
  •  … Сяолинь Ву

  Связь с природой Открытый доступ 28 июня 2022 г.

• Генерация и клинический потенциал функциональных Т-лимфоцитов из плюрипотентных стволовых клеток с отредактированными генами

  • Жунцюнь Го
  • , Вэй Ли
  •  … Юнпин Сун

  Экспериментальная гематология и онкология Открытый доступ 14 мая 2022 г.

• Разработка готовых инвариантных Т-клеток естественных киллеров, сконструированных из гемопоэтических стволовых клеток, для COVID-19терапевтическое вмешательство

  • Ян-Руиде Ли
  • , Закари Спенсер Данн
  •  … Лили Ян

  Исследование стволовых клеток и терапия Открытый доступ 21 марта 2022 г.

Варианты доступа

Подписаться на журнал

Получить полный доступ к журналу на 1 год

99,00 €

всего 8,25 € за номер

Подписаться

Расчет налога будет завершен во время оформления заказа.

Купить статью

Получите ограниченный по времени или полный доступ к статье на ReadCube.

32,00 $

Купить

Все цены указаны без учета стоимости.

Коды доступа

Первичные образцы

Омнибус экспрессии генов

• GSE94968

Ссылки

1. Schmitt, T. M. & Zúñiga-Pflücker, J.C. Индукция развития Т-клеток из гемопоэтических клеток-предшественников с помощью дельта-подобного-1 in vitro . Иммунитет 17 , 749–756 (2002 г.).

   КАС пабмед Google ученый

2. De Smedt, M., Hoebeke, I. & Plum, J. Костный мозг человека CD34 ⁺ клетки-предшественники созревают в Т-клетки на линии стромальных клеток OP9-DL1 без микроокружения тимуса. Клетки крови Мол. Дис. 33 , 227–232 (2004).

   КАС пабмед Google ученый

3. La Motte-Mohs, R.N., Herer, E. & Zuniga-Pflücker, J.C. Индукция развития Т-клеток из гемопоэтических стволовых клеток пуповинной крови человека с помощью дельта-подобных 1 in vitro . Кровь 105 , 1431–1439 (2005).

   КАС пабмед Google ученый

4. de Pooter, R. & Zúñiga-Pflücker, J.C. Потенциал и развитие Т-клеток in vitro : подход OP9-DL1. Курс. мнение Иммунол. 19 , 163–168 (2007).

   КАС пабмед Google ученый

5. Авонг Г., Херер Э., Ла Мотт-Мохс Р.Н. и Zúñiga-Pflücker, J.C. Т-клетки CD8 человека генерировали in vitro из гемопоэтических стволовых клеток являются функционально зрелыми. ВМС Иммунол. 12 , 22 (2011).

   КАС пабмед ПабМед Центральный Google ученый

6. Van Coppernolle, S. et al. Функционально зрелые клетки CD4 и CD8 TCR-αβ получают в культурах OP9-DL1 из гемопоэтических клеток CD34 ⁺ человека. Дж. Иммунол. 183 , 4859–4870 (2009).

   КАС пабмед Google ученый

7. Хао, К.Л. и другие. Приверженность внутритимусной линии человека отмечена дифференциальной экспрессией CD7: идентификация CD7 ^— лимфомиелоидных предшественников тимуса. Кровь 111 , 1318–1326 (2008).

   КАС пабмед ПабМед Центральный Google ученый

8. Де Смедт, М. и др. Потенциал дифференцировки Т-лимфоидов измерен in vitro выше в CD34 ⁺ CD38 ^−/lo гемопоэтических стволовых клеток из пуповинной крови, чем из костного мозга, и является неотъемлемым свойством клеток. Haematologica 96 , 646–654 (2011).

   КАС пабмед ПабМед Центральный Google ученый

9. Андерсон Г., Дженкинсон Э. Дж., Мур Н. К. и Оуэн Дж. Дж. Т. МНС класса II-положительные клетки эпителия и мезенхимы необходимы для развития Т-клеток в тимусе. Природа 362 , 70–73 (1993).

   КАС пабмед Google ученый

10. Plum, J., De Smedt, M., Defresne, M.P., Leclercq, G. & Vandekerckhove, B. Стволовые клетки печени человека CD34 ⁺ дифференцируются в Т-клетки в микроокружении тимуса мыши. Кровь 84 , 1587–1593 (1994).

    КАС пабмед Google ученый

11. Познанский М.С. и другие. Эффективное создание Т-клеток человека из тканеинженерного органоида тимуса. Нац. Биотехнолог. 18 , 729–734 (2000).

    КАС пабмед Google ученый

12. Чанг Б. и др. Разработка микроокружения тимуса человека для поддержки тимопоэза in vivo . Стволовые клетки 32 , 2386–2396 (2014).

    ПабМед ПабМед Центральный Google ученый

13. Авонг Г., Мотте-Мохс Р.Н.Л. & Zúñiga-Pflücker, J.C. In vitro Развитие человеческих Т-клеток, управляемое взаимодействием надрез-лиганд. в протоколах гемопоэтических стволовых клеток. (изд. Бантинг, К.Д.) 135–142 (Humana Press, 2008).

14. Шеридан Дж.М., Тауди С., Медвински А. и Блэкберн К.С. Новый метод создания реагрегированных органотипических культур, который позволяет сопоставлять определенные клеточные популяции. Бытие 47 , 346–351 (2009).

    ПабМед Google ученый

15. Ито, К. и др. Воспроизводимое создание гемопоэтических поддерживающих стромальных клеточных линий из мышиного костного мозга. Эксп. Гематол. 17 , 145–153 (1989).

    КАС пабмед Google ученый

16. Брюэр, Дж.Дж., Торричелли, Дж.Р., Эведж, Э.К. & Price, PJ Оптимизированная выживаемость нейронов гиппокампа в Neurobasal с добавлением B27, новой комбинации среды без сыворотки. Дж. Неврологи. Рез. 35 , 567–576 (1993).

    КАС пабмед Google ученый

17. Huijskens, M.J.A.J. и другие. Технический прогресс: аскорбиновая кислота индуцирует развитие дважды положительных Т-клеток из гемопоэтических стволовых клеток человека в отсутствие стромальных клеток. Дж. Лейкок. биол. 96 , 1165–1175 (2014).

    ПабМед Google ученый

18. Manning, J. et al. Витамин С способствует созреванию Т-клеток. Антиоксидант. Окислительно-восстановительный сигнал. 19 , 2054–2067 (2013).

    КАС пабмед ПабМед Центральный Google ученый

19. Casero, D. et al. Профилирование длинной некодирующей РНК лимфоидных клеток-предшественников человека выявляет транскрипционную дивергенцию линий В-клеток и Т-клеток. Нац. Иммунол. 16 , 1282–1291 (2015).

    КАС пабмед ПабМед Центральный Google ученый

20. Авонг, Г. и др. Характеристика in vitro и потенциал приживления in vivo человеческих Т-клеток-предшественников, полученных из гемопоэтических стволовых клеток. Кровь 114 , 972–982 (2009).

    КАС пабмед Google ученый

21. Vanhecke, D., Leclercq, G., Plum, J. & Vandekerckhove, B. Характеристика различных стадий дифференцировки человеческого CD69 ⁺ CD3 ⁺ тимоциты и идентификация эмигрантов из тимуса. Дж. Иммунол. 155 , 1862–1872 (1995).

    КАС пабмед Google ученый

22. Res, P., Blom, B., Hori, T., Weijer, K. & Spits, H. Понижающая регуляция CD1 отмечает приобретение функционального созревания тимоцитов человека и определяет контрольную точку на поздних стадиях Т человека. развитие клеток. Дж. Экспл. Мед. 185 , 141–151 (1997).

    КАС пабмед ПабМед Центральный Google ученый

23. Kimmig, S. et al. Две подгруппы наивных Т-хелперных клеток с различным содержанием эксцизионных кругов Т-клеточных рецепторов в периферической крови взрослого человека. Дж. Экспл. Мед. 195 , 789–794 (2002).

    КАС пабмед ПабМед Центральный Google ученый

24. Hinrichs, C.S. et al. Адаптивно перенесенные эффекторные клетки, полученные из наивных, а не центральных Т-клеток памяти CD8 ⁺ , опосредуют превосходный противоопухолевый иммунитет. Проц. Натл. акад. науч. США 106 , 17469–17474 (2009 г.).

    КАС пабмед ПабМед Центральный Google ученый

25. Рестифо, Н. П., Дадли, М.Е. и Розенберг, С.А. Адаптивная иммунотерапия или рак: использование Т-клеточного ответа. Нац. Преподобный Иммунол. 12 , 269–281 (2012).

    КАС пабмед ПабМед Центральный Google ученый

26. Гурка С., Диркс С., Фотиадис Дж. и Крочек Р.А. Анализ экспрессии поверхностных молекул на дендритных клетках тимуса человека с помощью панели антител 10th HLDA Workshop. клин. Перевод Иммунология 4 , e47 (2015).

    ПабМед ПабМед Центральный Google ученый

27. Мартинес В.Г. и другие. Дискретная популяция экспрессирующих IFN-λ дендритных клеток BDCA3 ^hi присутствует в тимусе человека. Иммунол. Клеточная биол. 93 , 673–678 (2015).

    ПабМед Google ученый

28. Хао, К.Л., Шах, А. Дж., Тиманн, Ф.Т., Смогоржевска, Э.М. и Крукс, Г.М. Функциональное сравнение клеток CD34 ⁺ CD38 ⁻ в пуповинной крови и костном мозге. Кровь 86 , 3745–3753 (1995).

    КАС пабмед Google ученый

29. Kohn, L.A. et al. Примирование лимфоидов в костном мозге человека начинается до экспрессии CD10 с активацией L-селектина. Нац. Иммунол. 13 , 963–971 (2012).

    КАС пабмед ПабМед Центральный Google ученый

30. Сикс, Э. М. и др. Постнатальный лимфоидный предшественник человека, способный циркулировать и засевать тимус. Дж. Эксп. Мед. 204 , 3085–3093 (2007 г.).

    КАС пабмед ПабМед Центральный Google ученый

31. Гали, А., Трэвис, М., Сен, Д. и Чен, Б. Человеческие Т, В, естественные клетки-киллеры и дендритные клетки возникают из общего подмножества клеток-предшественников костного мозга. Иммунитет 3 , 459–473 (1995).

    КАС пабмед Google ученый

32. Гшвенг, Э.Х. и другие. Позитронно-эмиссионная томография HSV-sr39TK и элиминация суицидного гена из гемопоэтических стволовых клеток человека и их потомства у гуманизированных мышей. Рак Рез. 74 , 5173–5183 (2014).

    КАС пабмед ПабМед Центральный Google ученый

33. Snauwaert, S. et al. Получение in vitro зрелых, наивных антиген-специфических CD8 ⁺ Т-клеток с одним Т-клеточным рецептором путем отбора агонистов. Лейкемия 28 , 830–841 (2014).

    КАС пабмед Google ученый

34. Джаннони, Ф. и др. Аллельное исключение и периферическая реконструкция трансгенными Т-клетками TCR, возникающими из трансдуцированных человеческих гемопоэтических стволовых клеток и клеток-предшественников. Мол. тер. 21 , 1044–1054 (2013).

    КАС пабмед ПабМед Центральный Google ученый

35. Чжао Ю. и др. Экстратимическая генерация опухолеспецифических Т-клеток из генетически модифицированных гемопоэтических стволовых клеток человека посредством передачи сигналов Notch. Рак Рез. 67 , 2425–2429 (2007).

    КАС пабмед ПабМед Центральный Google ученый

36. ван Лент, А.Ю. и другие. Функциональные антиген-специфические Т-клетки человека продуцировали in vitro с использованием ретровирусного переноса рецептора Т-клеток в гемопоэтические клетки-предшественники. J. Иммунол. 179 , 4959–4968 (2007 г.).

    КАС пабмед Google ученый

37. Гаттинони, Л. и др. Приобретение полной эффекторной функции in vitro парадоксальным образом снижает противоопухолевую эффективность in vivo адоптивно перенесенных CD8 ⁺ Т-клеток. Дж. Клин. Инвестировать. 115 , 1616–1626 (2005).

    КАС пабмед ПабМед Центральный Google ученый

38. Hinrichs, C.S. & Rosenberg, S.A. Использование лечебного потенциала адоптивной Т-клеточной терапии рака. Иммунол. 257 , 56–71 (2014).

    КАС пабмед ПабМед Центральный Google ученый

39. Ватакис Д.Н. и др. Введение экзогенных рецепторов Т-клеток в гемопоэтические предшественники человека приводит к исключению экспрессии эндогенного рецептора Т-клеток. Мол. тер. 21 , 1055–1063 (2013).

    КАС пабмед ПабМед Центральный Google ученый

40. Stärck, L., Popp, K., Pircher, H. & Uckert, W. Иммунотерапия TCR-перенаправленными T-клетками: сравнение TCR-трансдуцированных и TCR-инженерных гемопоэтических стволовых клеток, полученных из T-клеток. Дж. Иммунол. 192 , 206–213 (2014).

    ПабМед Google ученый

41. Торикай Х. и др. Основа универсальной иммунотерапии на основе Т-клеток: Т-клетки, сконструированные для экспрессии CD19-специфического химерного антигенного рецептора и устранения экспрессии эндогенного TCR. Кровь 119 , 5697–5705 (2012).

    КАС пабмед ПабМед Центральный Google ученый

42. Berdien, B., Mock, U., Atanackovic, D. & Fehse, B. Опосредованное TALEN редактирование эндогенных Т-клеточных рецепторов способствует эффективному репрограммированию Т-лимфоцитов путем переноса лентивирусного гена. Джин Тер. 21 , 539–548 (2014).

    КАС пабмед Google ученый

43. Пуаро, Л. и др. Мультиплексная платформа для производства Т-клеток с отредактированным геномом для готовой адоптивной Т-клеточной иммунотерапии. Рак Рез. 75 , 3853–3864 (2015).

    КАС пабмед Google ученый

44. Themeli, M., Rivière, I. & Sadelain, M. Новые источники клеток для Т-клеточной инженерии и адоптивной иммунотерапии. Cell Stem Cell 16 , 357–366 (2015).

    КАС пабмед ПабМед Центральный Google ученый

45. Сит, К.С., Крукс, Г.М. и Монтель-Хаген, А. Культуры искусственных органоидов тимуса: in vitro Дифференциация Т-клеток человека из гемопоэтических стволовых клеток и клеток-предшественников. Протокол. обмен (http://dx.doi.org/10.1038/protex.2017.062).

46. Маджети, Р., Парк, К.Ю. и Вайсман, И.Л. Выявление иерархии мультипотентных гемопоэтических предшественников в пуповинной крови человека. Cell Stem Cell 1 , 635–645 (2007).

    КАС пабмед ПабМед Центральный Google ученый

47. Роббинс, П. Ф. и другие. Одиночные и двойные аминокислотные замены в CDR TCR могут усиливать антиген-специфические функции Т-клеток. Дж. Иммунол. 180 , 6116–6131 (2008 г.).

    КАС пабмед Google ученый

48. Johnson, L.A. et al. Перенос гена опухоле-реактивного TCR придает как высокую авидность, так и опухолевую реактивность нереактивным мононуклеарным клеткам периферической крови и опухоль-инфильтрирующим лимфоцитам. J. Иммунол. 177 , 6548–6559 (2006 г.).

    КАС пабмед Google ученый

49. Джудичелли В., Шоме Д. и Лефранк М.-П. IMGT/GENE-DB: обширная база данных по человеческим и мышиным иммуноглобулинам и генам Т-клеточных рецепторов. Рез. нуклеиновых кислот. 33 , Д256–Д261 (2005 г.).

    КАС пабмед Google ученый

50. Кент, В. Дж. BLAT — инструмент выравнивания, подобный BLAST. Рез. генома. 12 , 656–664 (2002).

    КАС пабмед ПабМед Центральный Google ученый

Загрузить ссылки

Благодарности

Мы благодарим Дж. Шоулза и Ф. Кодреа из Центра исследования стволовых клеток Калифорнийского университета в Лос-Анджелесе (BSCRC) Core Flow Cytometry Core за помощь в сортировке FACS, Р. Чана за помощь в обработке образцов, C y Parekh (Детская больница Лос-Анджелеса) за щедрую помощь с образцами тимуса, M. Sehl (UCLA) за помощь в сборе MPB и A. Cooper (UCLA) за полезные советы и обсуждение. Мы благодарим И. Антошечкина (Лаборатория генетики и геномики Милларда и Мюриэл Джейкобс, Калифорнийский технологический институт), разработавшего метод анализа секвенирования TCR и оказавшего помощь в его проведении, А. Рибаса (UCLA) за исследования NY-ESO-1 и MART-1. Конструкции TCR, J. Zuniger-Pflucker (Университет Торонто) для OP9-клетки DL1, L. Coulombel для клеток MS-5 и J. Chute (UCLA) для клеток U266. Эта работа была поддержана NIH (гранты R01 AG049753 (G.M.C.), 1R21AI119927 (G.M.C. и A.M.-H.), P01 HL073104 (G.M.C. и D.B.K.) и T32HL066992 (C.S.S.)), Tower Cancer Research Foundation (C.S.S.), UCLA Награда BSCRC за инновации (GMC и DBK) и клиническая стипендия BSCRC (CSS). МТБ и Д.Б. поддерживаются Премией 15CHAL02 Фонда рака простаты и M.T.B. является получателем постдокторской стипендии Джейн Коффин Чайлдс. Основные услуги поддерживались общим учреждением Комплексного онкологического центра Калифорнийского университета в Лос-Анджелесе (TPCL, грант 5P30CA016042), Центром иммуногенетики Калифорнийского университета в Лос-Анджелесе, Основной лабораторией вирусологии Центра исследований СПИДа Калифорнийского университета в Лос-Анджелесе и Институтом СПИДа Калифорнийского университета в Лос-Анджелесе (грант 5P30 AI02869).7), а также Лаборатория генетики и геномики Милларда и Мюриэл Джейкобс в Калифорнийском технологическом институте.

Информация об авторе

Примечания автора

1. Гей М. Крукс и Амели Монтель-Хаген: Эти авторы внесли одинаковый вклад в эту работу.

Авторы и организации

1. Отделение гематологии-онкологии, медицинский факультет, Медицинская школа Дэвида Геффена (DGSOM), Калифорнийский университет в Лос-Анджелесе (UCLA), Лос-Анджелес, Калифорния, США

   Christopher S Seet

2. Департамент патологии и лабораторной медицины, DGSOM, UCLA, Лос-Анджелес, Калифорния, США

   Chongbin He, Suwen Li, Brent Chick, Yuhua Zhu, Kenneth Kim, Gay M Crooks и Amélie Montel- Hagen

3. Отделение биологии и биологической инженерии Калифорнийского технологического института (Калифорнийский технологический институт,

   Майкл Т. Бетьюн и Дэвид Балтимор

4. ), Пасадена, Калифорния, США

   Michael T Bethune и David Baltimore

5. Департамент микробиологии, иммунологии и молекулярной генетики DGSOM, UCLA, Лос-Анджелес, Калифорния, США , Департамент педиатрии, DGSOM, Калифорнийский университет в Лос-Анджелесе, Лос-Анджелес, Калифорния, США

   Дональд Б. Кон и Гей М. Крукс

6. Центр регенеративной медицины и исследований стволовых клеток Эли и Эдит Брод, Калифорнийский университет в Лос-Анджелесе, Лос-Анджелес, Калифорния, США

   Donald B Kohn & Gay M Crooks

7. Jonsson Complosseduce Center, UCLA, Лос -Анджелес, Калифорния, США

   Donald B Kohn & Gay M -Crook

Авторы

9 Selecter Sepors
99017PHEHER SEALSERTHER.

Вы также можете искать этого автора в PubMed Google Scholar

1. Chongbin He

   Просмотр публикаций автора

   Вы также можете искать этого автора в PubMed Google Академия

2. Michael T Bethune

   Просмотр публикаций автора

   Вы также можете искать этого автора в PubMed Google Scholar

3. Suwen Li

   Просмотр публикаций автора

   Вы также можете искать этого автора в PubMed Google Scholar

4. Brent Chick

   Просмотр публикаций автора

   Вы также можете искать этого автора в PubMed Google Scholar

5. Эрик Х. Гшвенг

   Просмотр публикаций автора

   Вы также можете искать этого автора в PubMed Google Scholar

6. Yuhua Zhu

   Просмотр публикаций автора

   Вы также можете искать этого автора в PubMed Google Scholar

7. Kenneth Kim

   Просмотр публикаций автора

   Вы также можете искать этого автора в PubMed Google Scholar

8. Дональд Б. Кон

   Посмотреть публикации автора

   Вы также можете искать этого автора в PubMed Google Scholar

9. David Baltimore

   Просмотр публикаций автора

   Вы также можете искать этого автора в PubMed Google Scholar

10. Gay M Crooks

    Посмотреть публикации автора

    Вы также можете искать этого автора в PubMed Google Scholar

11. Амели Монтель-Хаген

    Посмотреть публикации автора

    Вы также можете искать этого автора в PubMed Google Scholar

Contributions

C. S.S. и А.М.-Х. разработал и провел эксперименты, проанализировал данные, подготовил рисунки и написал рукопись в соавторстве; К.Х. провел гистологические эксперименты и вместе с BC помог провести экспериментов in vivo в экспериментах; С.Л. помогал с анализом АТО и функциональными анализами Т-клеток; К.К. помощь с культурами ATO; Ю.З. выполняли обработку образцов человека и культивировали клеточные линии; Э.Х.Г. и Д.Б.К. предоставил критические реагенты и концептуальные рекомендации и отредактировал рукопись; МТБ и Д.Б. разработал подход и провел анализ секвенирования репертуара TCR и предоставил критические реагенты; и Г.М.С. и А.М.-Х. соруководил проектом и соавтором рукописи.

Автор, ответственный за переписку

Переписка с Гей М Крукс.

Декларации этики

Конкурирующие интересы

Kite Pharma, Inc. поддерживает доклинические исследования системы ATO в Калифорнийском университете в Лос-Анджелесе совместно с G.M.C. в качестве главного следователя. Kite Pharma, Inc. также владеет эксклюзивной лицензией на определенную интеллектуальную собственность, относящуюся к системе ATO.

Встроенная дополнительная информация

Дополнительный рисунок 1 АТО образуют твердые тканеподобные структуры.

Окрашивание гематоксилином и эозином, показывающее тканевую архитектуру 3D-культур 6-й недели, полученных с помощью CB HSPC и MS5-hDLL1 (т.е. ATO) (слева), родительских клеток MS-5 (в центре) или только клеток MS5-hDLL1 (справа). Увеличение 100X (верхний ряд) или 400X (нижний ряд).

Дополнительный рисунок 2 Начальное количество HSPC на ATO влияет на выход клеток на HSPC, но не на общий выход клеток или дифференцировку Т-клеток.

(a) Общее количество клеток и выход на входные HSPC на неделе 6 ATO, полученные с различным количеством CD34+CD3-CB HSPC (0,3-30×10 ³ на ATO) и постоянное количество стромальных клеток MS5-hDLL1 (1,5×10 ⁵ на ATO). Сравнение показано в крайнем правом углу каждого графика с более крупными ATO (с использованием 30×10 ³ HSPC и 6×10 ⁵ стромальных клеток в соотношении 1:20). (b) Частота предшественников Т-клеток и зрелых Т-клеток в АТО, как описано в (a) . Показаны среднее значение и стандартное отклонение для тройных ATO. Данные являются репрезентативными для двух независимых экспериментов.

Дополнительный рисунок 3 Дифференцировка Т-клеток в ATOs является высоко воспроизводимой и не зависит от вариации партии B27, отсутствия ксенона B27 или стромального облучения.

Нет значительного влияния вариации партии B27 на (a) коммитацию Т-линии, (b-c) дифференцировку Т-клеток или (d) общее количество клеток на 6-й неделе ATO, полученных из одного CB (7,5×10 ³ CD34+CD3- HSPC на ATO) и культивировали с использованием 4 разных партий добавки B27 (обозначены A-D). Повторные ATO (n=2-3) показаны для каждой партии B27. Замена стандартного B27 на свободный от ксенов B27 не оказала существенного влияния на дифференцировку (e) Т-клеток или (f) общее количество ячеек за неделю 6 ATO. Облучение стромальных клеток MS5-hDLL1 в дозе 20-80 Гр до генерации АТО мало влияло на дифференцировку (g-i) Т-клеток или (j) общего количества клеток и CD3+TCRαβ+CD8SP Т-клеток. Показаны среднее значение и стандартное отклонение для тройных ATO. Данные являются репрезентативными для двух отдельных экспериментов. Графики потоков в (h) показывают клетки из ворот CD3+TCRαβ+, показанные на (g). (k) Сбор клеток из АТО путем механического разрушения через 6 недель привел к суспензии >99% гемопоэтических клеток CD45+ человека (вверху) и <0,5% стромальных клеток GFP+ (внизу). Частоты показаны для 8 независимых экспериментов (планки погрешностей представляют стандартное отклонение).

Дополнительный рисунок 4. Повышенная положительная селекция и созревание Т-клеток в ATO по сравнению с совместными культурами монослоя OP9-DL1.

Представлены данные полнопроточной цитометрии для рис. 2а, показывающие дифференцировку Т-клеток от трех разных доноров пуповинной крови (№1, №2 и №3) через (а) через 4 недели и (б) через через 6 недель. АТО и ОП9Культуры -DL1 запускали параллельно с CD34+CD3- HSPC из тех же единиц пуповинной крови. Клетки гейтируются по общему количеству CD14-CD56-клеток или CD3+TCRαβ+ Т-клеток, как указано. (c) Абсолютное количество клеток субпопуляций Т-клеток на 4 и 6 неделе в совместных культурах OP9-DL1 по сравнению с ATO с использованием стратегии селекции, показанной на (a) и (b). Каждая культура OP9-DL1 была инициирована 1,5×10 ⁴ клеток HSPC CD34+CD3-CB, а каждая ATO была инициирована 7,5×10 ³ HSPCs из одной и той же единицы пуповинной крови, с техническими дубликатами ATO, собранными и объединенными в указанные сроки. раз для сравнения количества клеток. Столбцы представляют среднее значение и стандартное отклонение трех независимых экспериментов.

Дополнительный рисунок 5 Для усиленного положительного отбора в ATO требуется трехмерная структура, оптимальная клеточная линия и культуральная среда.

Повышенная положительная селекция и созревание Т-клеток в ATO (определяется как MS5-hDLL1 в 3D-культуре с RB27) по сравнению с однослойными совместными культурами. Культуры монослоя 6-й недели (слева) сравнивали с культурами 3D-органоидов (справа) и включали перекрестные сравнения либо с клетками MS5-DL1, либо с клетками OP9-DL1 и средой RB27 или стандартной средой OP9-DL1, как указано. Стандартная среда для OP9Совместные культуры -DL1 представляли собой MEMα/20% FCS с IL-7, FLT3L и аскорбиновой кислотой, а стандартной средой для ATO была RB27 с IL-7, FLT3L и аскорбиновой кислотой, как описано в Methods . Монослойные или трехмерные культуры с использованием исходной клеточной линии MS-5 (не трансдуцированные DLL1 ) также показаны в качестве отрицательного контроля. Все графики гейтированы на CD14-CD56-клетках или (где указано) субгейтах CD3+TCRαβ+.

Дополнительный рисунок 6 Резюме тимопоэза и фенотипа наивных Т-клеток в АТО.

(a) Прогрессирующая дифференцировка наивных клеток CD3+TCRαβ+CD8SP и CD3+TCRαβ+CD4SP в АТО между 6-10 неделями. ATO культивировали параллельно с использованием CB HSPC от одного донора и анализировали в указанные недели. Клетки гейтированы по клеткам CD14-CD56-TCRαβ+CD3+, а последовательные субгейты (CD8SP или CD4SP) указаны выше на графиках. Соответствующий момент времени 12-й недели показан на рис. 2. (b,c) Дополнительные маркеры, характеризующие фенотип 12-й недели CD3+TCRαβ+ (b) CD8SP и (c) CD4SP T-клеток по сравнению с соответствующими популяциями в тимусе человека (см. также рис. 2). (d) Частота HLA-DR+ клеток в CB ATOs по сравнению с постнатальным тимусом (по общему количеству CD45+ клеток). (e) Множественные популяции антигенпрезентирующих клеток HLA-DR+ (APC) присутствуют на 6-й неделе ATO. Последовательные ворота показаны над каждым графиком. Популяции HLA-DR+ включают моноциты (CD14+), гранулоциты (CD66b+), В-клетки (CD19+), HSPC (CD34+), плазмоцитоидные ДК (CD303+CD123+), CLEC9A+ DC (CD141+CLEC9A+) и CD1c+ DC (CD1c+CLEC9A-). Для сравнения показан парный анализ из постнатальной вилочковой железы. Данные в (d) и (e) являются репрезентативными для трех независимых экспериментов.

Дополнительный рисунок 7. Генерация Т-клеток из нескольких источников и подмножеств HSPC.

(a) Сохранение клеток CD34+ на 6-й неделе ATO, инициированных с использованием пуповинной крови человека (CB), взрослого костного мозга (BM), мобилизованной G-CSF периферической крови (MPB) или немобилизованной периферической крови (PB) HSPC. (b) Субпопуляции предшественников Т-клеток в ATO из разных источников HSPC, гейтированные на клетках CD34+, как показано на (a). (c) CD34+-предшественников и (d) CD34+-подмножеств предшественников на 6-й неделе ATO, начатых с обогащенными гемопоэтическими стволовыми клетками (HSC) (Lin-CD34+CD38-) фракциями из показанных источников ткани. (e, f) Раннее начало фиксации Т-клеток из LMPP и CD24-CLP в течение 3 недель ATO, выявленное (e) ранним появлением DP и (f) Т-клетками, коммитирующими CD34+CD7+ предшественников. Данные являются репрезентативными для двух независимых экспериментов.

Дополнительный рисунок 8 Разнообразие TCR и функциональная проверка полученных из ATO CD4

⁺ Т-клеток.

(a) Подобно тимоцитам человека, RAG1 и RAG2 экспрессируются в CD3+CD4+CD8+ (DP), происходящих из АТО, но не в зрелых CD3+CD8SP Т-клетках. Показана количественная ОТ-ПЦР для RAG1 и RAG2 относительно экспрессии B2M в FACS-отсортированных популяциях Т-клеток, полученных из АТО, по сравнению с постнатальными популяциями Т-клеток тимуса. Показаны среднее значение и стандартное отклонение для трех повторных реакций. (b) Генерация разнообразия TCR в CD3+TCRαβ+CD4SP Т-клетках, выделенных из ATO на 7-й неделе (n=5) или тимуса человека (n=4), как показано с помощью проточного цитометрического анализа частоты экспрессии TCR семейства Vβ . (c) Продукция цитокинов 12-й неделей Т-клеток CD4SP, полученных из АТО, обработанных ФМА/иономицином в течение 6 часов. Данные являются репрезентативными для двух независимых экспериментов. (d) Пролиферация (разведение CTV) и активация (усиление CD25) CD4SP Т-клеток пуповинной крови (CB) и полученных из АТО (неделя 12) через 5 дней в ответ на анти-CD3/CD28 и IL-2. Данные являются репрезентативными для двух отдельных экспериментов. (e) Экспансия Т-клеток CD4SP, происходящих из АТО, после ATO относительно исходного количества клеток в ответ на анти-CD3/CD28 и IL-2 через 7 и 14 дней. Показаны среднее значение и стандартное отклонение технических трехкратных повторов.

Дополнительный рисунок 9 Дифференциация и аллельное исключение TCR-инженерных Т-клеток в ATO.

(a) TCR-инженерные T-клетки, полученные из ATO, сохраняют обычный фенотип T-клеток, несмотря на экспансию и повторную стимуляцию. CB HSPC трансдуцировали HLA-A*0201/NY-ESO-1 _157-165 , специфичные для TCR, а затем культивированные в ATO. Через 6 недель Т-клетки CD8SP выделяли из АТО и активировали гранулами анти-CD3/28 + ИЛ-2, размножали в ИЛ-2 и повторно стимулировали гранулами анти-CD3/28 на 14-й день. экспрессию CD8α и CD8β подтверждали с помощью проточной цитометрии. Данные являются репрезентативными для двух независимых экспериментов. (b) Проточный цитометрический анализ Vβ CD3+TCRαβ+тетрамер+CD8SP Т-клеток из TCR-трансдуцированных CB ATO. Данные являются репрезентативными для 5 независимых экспериментов (показаны в графической форме на рис. 5g). (c) Создание TCR-инженерных Т-клеток из TCR-трансдуцированных CB HSPC в ATO с использованием HLA-A*02:01/MART1 _26-35 TCR. Показана дифференцировка на 6-й неделе (гейтирование по общему количеству клеток CD14-CD56-ATO, с последовательными гейтами, показанными над каждым графиком). Данные являются репрезентативными для двух независимых экспериментов. (d) Антиген-специфический прайминг MART1-специфичных и NY-ESO-1-специфичных Т-клеток, полученных из ATO, сконструированных с помощью TCR, с помощью искусственных антигенпрезентирующих клеток (aAPC), которые экспрессируют CD80 и одиночный HLA-A*02:01 цепной тример, представляющий либо MART1 _26-35 или пептид NY-ESO1 _156-165 . Показана мобилизация мембраны CD107a и окрашивание внутриклеточного IFNγ через 6 часов. (e) In vitro Цитотоксичность полученных из ATO TCR-инженерных T-клеток против антиген-положительных опухолевых клеток. Частоты ранних (аннексин V+DAPI-) или поздних (аннексин V+DAPI+) апоптотических опухолевых клеток определяли с помощью проточной цитометрии через 9 ч (данные суммированы на рис. 6з). (f) Сохранение антигенной специфичности после длительной активации/экспансии Т-клеток после АТО. Т-клетки CD8SP, выделенные из трансдуцированных TCR ATO, размножали в течение 14 дней с помощью анти-CD3/28 и IL-2, и проводили анализы цитотоксичности, как описано на панели (f) и фиг. 6h. Для сравнения показаны анализы с использованием TCR-трансдуцированных CD8+ донорских Т-клеток периферической крови, размножающихся в течение 14 дней в тех же условиях.

Supplementary information

Supplementary Text and Figures

Supplementary Figures 1–9 (PDF 2366 kb)

Supplementary Protocol

DETAILED ARTIFICIAL THYMIC ORGANOID (ATO) METHOD (PDF 3240 kb)

Rights and permissions

Reprints and Разрешения

Об этой статье

Эта статья цитируется

• Генерация и клинический потенциал функциональных Т-лимфоцитов из плюрипотентных стволовых клеток с отредактированными генами

  • Жунцюнь Го
  • Вэй Ли
  • Юнпин Сун

  Экспериментальная гематология и онкология (2022)

• Разработка готовых инвариантных Т-клеток естественных киллеров, сконструированных из гемопоэтических стволовых клеток, для терапевтического вмешательства при COVID-19

  • Ян-Руиде Ли
  • Закари Спенсер Данн
  • Лили Ян

  Исследование стволовых клеток и терапия (2022)

• Многоцелевая оптимизация выявляет зависимую от времени и дозы опосредованную воспалительными цитокинами регуляцию развития Т-клеток, полученных из стволовых клеток человека.

  
  • Джон М. Эдгар
  • Йель С. Майклс
  • Питер В. Зандстра

  npj Регенеративная медицина (2022)

• Скрытый сплайсинг лентивектора опосредует увеличение клонов CD34+, экспрессирующих укороченный HMGA2, при Х-сцепленном тяжелом комбинированном иммунодефиците человека

  • Сук Си Де Равин
  • Сиюань Лю
  • Сяолинь Ву

  Nature Communications (2022)

• DL4-μbeads индуцируют дифференцировку линии Т-клеток из стволовых клеток в системе, не содержащей стромальных клеток.